導(dǎo)語：鄰近標(biāo)記（Proximity Labeling, PL）是繪制細(xì)胞“空間蛋白質(zhì)組學(xué)"的神兵利器，但面對(duì)原代T細(xì)胞這類“硬骨頭"（難轉(zhuǎn)染、體外存活短），傳統(tǒng)工具往往力不從心。近期，中山大學(xué)腫瘤防治中心的研究團(tuán)隊(duì)在BBRC上發(fā)表了一項(xiàng)創(chuàng)新工作：他們基于酪氨酸酶BmTyr搭建了一套生物正交鄰近標(biāo)記平臺(tái)在該研究中，團(tuán)隊(duì)借助 Nanoportal Biotech 自主研發(fā)的 ProteanFect® 功效型轉(zhuǎn)染試劑，成功攻克了原代 T 細(xì)胞極難轉(zhuǎn)染的傳統(tǒng)痛點(diǎn)，高效遞送 mRNA 并實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞水平的精準(zhǔn)標(biāo)記。 結(jié)合全新的 HiBiT/His 雙標(biāo)簽系統(tǒng)，該團(tuán)隊(duì)成功繪制了原代 T 細(xì)胞的核蛋白組動(dòng)態(tài)圖譜，并意外發(fā)現(xiàn)了蛋白 NKAP 的“染色質(zhì)定位"新功能。

研究背景：鄰近標(biāo)記的“阿喀琉斯之踵"

想要知道細(xì)胞內(nèi)誰和誰互作、特定細(xì)胞器里有哪些蛋白，傳統(tǒng)方法是裂解細(xì)胞后做Co-IP，但這會(huì)破壞瞬時(shí)互作，還可能產(chǎn)生人為假陽性。鄰近標(biāo)記技術(shù)（如BioID、APEX2）通過表達(dá)融合酶，在活細(xì)胞內(nèi)給“鄰居蛋白"貼標(biāo)簽，再結(jié)合質(zhì)譜分析，規(guī)避了這些問題。

但現(xiàn)有工具各有短板：

·  BioID/TurboID（生物素連接酶）：依賴內(nèi)源生物素途徑，背景高；

·  APEX2（過氧化物酶）：需要添加具有細(xì)胞毒性的 H?O?，對(duì)嬌貴的原代細(xì)胞（如懸浮生長的T細(xì)胞）很不友好；

通用痛點(diǎn)：原代T細(xì)胞極難轉(zhuǎn)染，且體外培養(yǎng)壽命短，常規(guī)質(zhì)?；虿《巨D(zhuǎn)染引發(fā)的先天免疫響應(yīng)還會(huì)干擾免疫信號(hào)研究。

為此，該研究團(tuán)隊(duì)將目光投向了 BmTyr（細(xì)菌酪氨酸酶）。這是一種銅依賴酶，能將苯酚探針氧化為鄰醌，進(jìn)而標(biāo)記鄰近蛋白。它不需要H?O?，條件溫和，非常適合敏感的原代細(xì)胞。

核心創(chuàng)新：一套“好用、靈敏、易洗脫"的全新工具箱

1. 優(yōu)化探針與反應(yīng)體系 

團(tuán)隊(duì)比較了傳統(tǒng)的生物素-苯酚（Biotin-phenol）和分子量更小的炔基-苯酚（Alkyne-phenol）(圖1A)。對(duì)炔基苯酚濃度進(jìn)行了滴定。濃度低于0.015 mM未檢測(cè)到信號(hào)，而0.5 mM導(dǎo)致彌散的非核標(biāo)記，表明是非特異性探針結(jié)合。中間濃度0.15 mM炔基苯酚提供了最佳的信號(hào)背景比和精確的核限制性（圖1D和E）。他們還將酶定位在細(xì)胞核（mCherry-BmTyr-H2B），驗(yàn)證了其在亞細(xì)胞水平上的精準(zhǔn)標(biāo)記能力。

圖1 生物素-苯酚與炔基-苯酚探針在BmTyr介導(dǎo)的鄰近標(biāo)記中的比較

2. 攻克“洗脫難"：HiBiT/His 雙標(biāo)簽系統(tǒng) 

這是本文的一大技術(shù)亮點(diǎn)。傳統(tǒng)的富集金標(biāo)準(zhǔn)是用疊氮-生物素（Azide-biotin）結(jié)合鏈霉親和素（Streptavidin），但生物素-親和素結(jié)合太牢，洗脫極其困難，導(dǎo)致后續(xù)Western Blot驗(yàn)證效率低下。

解決方案：合成一種定制的疊氮-HiBiT標(biāo)簽，用于與炔基標(biāo)記的蛋白質(zhì)組偶聯(lián)（圖2A）。

His標(biāo)簽：負(fù)責(zé)通過Ni-NTA磁珠高效捕獲和溫和洗脫蛋白；

HiBiT標(biāo)簽：這是一個(gè)僅11個(gè)氨基酸的微小肽段，能與LgBiT蛋白互補(bǔ)形成納米螢光素酶，實(shí)現(xiàn)超靈敏的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)（無需抗體！）。

為降低成本，團(tuán)隊(duì)將定制的疊氮-HiBiT標(biāo)簽與市售的疊氮-6×His或疊氮-10×His標(biāo)簽按等摩爾比混合（圖2B和C）。兩種His標(biāo)簽變體都成功富集了炔基標(biāo)記的蛋白質(zhì)組，其中疊氮-10×His提供了略優(yōu)的富集效率（圖2D和E）。隨后的HiBiT標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)了對(duì)洗脫蛋白的靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，滿足了高靈敏度， 生物正交性， 高效洗脫性的初始設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。

圖2利用雙疊氮標(biāo)簽系統(tǒng)對(duì)鄰近標(biāo)記蛋白質(zhì)組進(jìn)行免疫沉淀及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

3. BmTyr用于原代T細(xì)胞核蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜分析 

平臺(tái)應(yīng)用于原代T細(xì)胞解決方案：

·  遞送：采用ProteanFect介導(dǎo)的mRNA轉(zhuǎn)染，12小時(shí)內(nèi)即可表達(dá)蛋白，避免了DNA引起的cGAS-STING通路激活（這點(diǎn)在免疫細(xì)胞中至關(guān)重要），轉(zhuǎn)染效率超50%（圖3C）。

·  安全性：優(yōu)化了Cu2?濃度（僅10 μM，遠(yuǎn)低于常規(guī)CuAAC的4 mM），流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)對(duì)T細(xì)胞無明顯毒性（圖3A）。

隨后，將這一優(yōu)化系統(tǒng)應(yīng)用于分析腫瘤壞死因子-α（TNFα）刺激后T細(xì)胞核蛋白質(zhì)組的變化。構(gòu)建野生型（WT）和TNFR1敲除（TNFR1-KO）T細(xì)胞，使其表達(dá)核定位的mCherry-BmTyr-H2B融合蛋白，用TNFα（10 ng/ml，6小時(shí)）處理并進(jìn)行鄰近標(biāo)記。質(zhì)譜分析鑒定出116個(gè)變化顯著的核蛋白，其中20個(gè)蛋白在WT+TNFα組中特異性富集，且在TNFR1-KO組中無變化（圖3F），主要涉及轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控，完·美驗(yàn)證了平臺(tái)的可靠性（圖3G）。

圖3原代T細(xì)胞核蛋白質(zhì)組的鄰近標(biāo)記與質(zhì)譜分析

生物學(xué)發(fā)現(xiàn)：繪制圖譜與NKAP的新故事

NKAP是NF-κB激活蛋白，已知TNFα刺激后核轉(zhuǎn)位，但其染色質(zhì)結(jié)合機(jī)制未知，故被選為驗(yàn)證靶點(diǎn)。

·  利用新的HiBiT/His標(biāo)簽系統(tǒng)捕獲發(fā)現(xiàn)：TNFα刺激后，與染色質(zhì)關(guān)聯(lián)的NKAP顯著增多，而總核蛋白水平變化不大（圖4B）。

·  在骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDM）中重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到完·全一致結(jié)果：NKAP以TNFR1依賴的方式結(jié)合染色質(zhì)這一現(xiàn)象，在不同原代細(xì)胞中可重復(fù)，進(jìn)而佐證了本研究體系具有普適性，而非T細(xì)胞特·有（圖4E）。

這意味著，TNFα-TNFR1信號(hào)并未簡單改變NKAP的總量或核質(zhì)分布，而是促進(jìn)了NKAP與染色質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)合（可能涉及HDAC復(fù)合物），為其轉(zhuǎn)錄抑制功能提供了新視角。

圖4 NKAP作為TNFα信號(hào)通路染色質(zhì)相關(guān)下游效應(yīng)分子的驗(yàn)證

總結(jié)與展望

這項(xiàng)研究開發(fā)的 BmTyr 無生物素鄰近標(biāo)記平臺(tái)，以溫和低毒、高效精準(zhǔn)、兼容點(diǎn)擊化學(xué)的核心優(yōu)勢(shì)，徹·底解決了原代 T 細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組解析難題。

    值得一提的是，Nanoportal Biotech 的 ProteanFect® 轉(zhuǎn)染試劑在本次攻堅(jiān)克難中展現(xiàn)了卓·越的性能——它不僅攻克了原代免疫細(xì)胞“難轉(zhuǎn)染"的阿喀琉斯之踵，更以高效率、低毒性、不激活先天免疫的高標(biāo)準(zhǔn)，完·美保障了后續(xù)質(zhì)譜鑒定與功能驗(yàn)證的順利進(jìn)行。  

    ProteanFect® 始終致力于為“難轉(zhuǎn)染"細(xì)胞與前沿遞送研究提供最·強(qiáng)技術(shù)底座。無論您的研究是深耕空間蛋白質(zhì)組學(xué)，還是聚焦前沿基因與細(xì)胞治療，ProteanFect® 都能助力您的科研工作加速?zèng)_刺！

買試劑，找華雅，華雅思創(chuàng)作為西湖凝聚體的代理商，為您提供ProteanFect® 轉(zhuǎn)染試劑現(xiàn)貨，歡迎咨詢